使用液相色谱和柱后光化学衍生方法同时测定四种黄曲霉毒素
黄曲霉毒素是一种由真菌产生的有毒的致癌物质。这种真菌在合适的温度湿度条件下会在土壤，谷物，坚果或腐烂的植物中生长。自然界中自然产生的黄曲霉毒素至少有 14 种之多，其中毒性最大的是黄曲霉毒素 B1。因此，很多国家和法规机构都对食物中黄曲霉毒素 B1 的含量做了严格规定，通常，对毒性比 B1 略小的其他三种黄曲霉毒素 B2，G1 和 G2 的含量也会做出相应规定。例如欧盟规定黄曲霉毒素 B1 的在食物如谷物，坚果中的含量最大允许范围在 2.0 到 8.0 µg/kg (ppb) 之间，上述四种黄曲霉毒素总含量允许值范围在 4.0 到 15.0 µg/kg (ppb) 之间。美国 FDA 规定食品含量限定值为 20 µg/kg，饲料含量限值为 300 µg/kg。中国国标GBT 18979-2003 规定四种黄曲霉毒素总量检出限应为1µg/kg。黄曲霉毒素测定通常使用液相色谱-荧光检测的方法完成。但是由于有些黄曲霉毒素在含水流动相中会发生荧光淬灭，所以需要采取一定的衍生技术将它们衍生为不会淬灭的型态。目前应用比较普遍的衍生方法是在溴的作用下进行柱后电化学衍生。这种方法有很好的灵敏度，但是也有很多缺点，比如需要使用到对仪器有强烈腐蚀作用的含溴流动相，并且衍生装置需要定期维护。
另一种衍生方法是使用紫外光使黄曲霉毒素与水进行衍生反应，由于水是反相色谱中的常用溶剂，所以这种方法操作十分简便，并且在灵敏度上与电化学衍生方法也有较好的可比性。在这篇应用报告中，我们在四元泵液相色谱系统上开发了一个灵敏快速的用于分析黄曲霉毒素 B1，B2，G1 和G2 检测的柱后光化学衍生-荧光检测方法，这个方法在定量限和检出限上的表现完全可以满足各个主要法规的要求。
仪器
液相色谱系统:
四元泵 (G1311B)
标准自动进样器 (G1329B)
柱温箱 (G1316A)
(G1312B)，配置标准检测池(8 µL)
• 柱后光化学衍生装置，柱后衍生装置串联于色谱柱出口与荧光检测器入口之间
色谱柱
免疫亲和小柱C18
溶剂和试剂
溶剂
甲醇 (HPLC 级)
标准品
黄曲霉毒素标准品 (99%+ B1: 1.055 µg/mL, B2: 0.327 µg/mL,
G1: 1.082 µg/mL and G2: 0.309 µg/mL 溶解于甲苯/乙腈 (98:2))
加标玉米粉样品为在样品前处理前 向上述玉米粉样品中加入相当于标准曲线级别 4 的标准品（浓度数 值见表 1）。
标准添加玉米粉样品（含有 9.00 ppb B1 和 0.6 ppb
B2）。
芝麻酱样品（含有 4.57 ppb B1，其他三
种浓度未知）。
酸枣仁样品（2010 版中国药典规定进行
黄曲霉毒素检测）。
样品和标准品制备
标准溶液配制：取 10 µL 标准品溶液置于 10 mL 瓶中，室温下氮气
吹干，用甲醇-水溶液 (50:50, v:v) 复溶，之后稀释成如下浓度作为
标准曲线不同浓度点
| 表 1. 浓度级别 | ||||||
| 浓度级别 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| B1 | 0.1055 | 0.2638 | 0.5275 | 1.055 | 5.275 | 10.55 |
| B2 | 0.0327 | 0.0818 | 0.1635 | 0.327 | 1.635 | 3.27 |
| G1 | 0.1082 | 0.2705 | 0.541 | 1.082 | 5.41 | 10.82 |
| G2 | 0.0309 | 0.0772 | 0.1545 | 0.309 | 1.545 | 3.09 |
样品处理：取 5g 样品（见表 2）和 0.5 g 氯化钠置于 50 mL 离心管中，加入 25 mL 甲醇-水溶液 (70:30, v:v)，高速匀浆 1 分钟，5000 转离心 5 分钟，取 5 mL 上清液，加入 15 mL 水，转移全部的 20 mL 溶液经过免疫亲和小柱净化：
| 样品 | 玉米粉 | 加标玉米粉 | 标准添加玉米粉 | 芝麻酱 | 酸枣仁 |
| 重量 (g) | 5.03 | 5.00 | 4.99 | 4.96 | 4.98 |
免疫亲和小柱净化过程：1. 用 2 mL 超纯水活化小柱2. 将要净化的样品加入到小柱上，控制流速在 1 滴/秒，使样品溶液流过小柱3. 用 10 mL 超纯水清洗小柱，弃去洗脱液4. 用注射器打气排空小柱大概 10 秒以排干小柱内的残留液体5. 使用 0.5 mL 甲醇以 1 滴/秒的速度洗脱小柱，确保洗脱全部黄曲霉毒素6. 用注射器打气排空小柱收集全部洗脱液7. 向洗脱液中加入 0.5 mL 超纯水，涡旋混匀8. 0.22 µm 滤膜过滤
色谱条件色谱柱: C18, 3.0 x 50 mm, 2.7 µm(p/n 699975-302)流动相: 水/甲醇 65:35 (v:v), 等度停止时间: 13.5 min流速: 0.4 mL/min进样量: 10 µL柱温: 30 °C检测器参数: Ex.: 365 nm, Em.: 440 nm, 采样频率: 1.16 Hz, 增益: 10
结果
使用上述方法对四种黄曲霉毒素标准品（第 4 级浓度，蓝色图）进行了分析并与空白进样（红色）进行了比较，结果见图 1，根据色 谱图可以看到四种黄曲霉毒素可以在 13.5 分钟内达到良好的基线 分离。图中可以看到色谱峰有较大展宽，这主要是由于样品经过光衍生装置中的衍生管造成的，为了保证足够的反应时间，不能使用很高的流速，这导致了样品峰在管线中的扩散。
峰面积和保留时间重现性
对标准品（浓度级别 4）进行了 6 次重复的分析考察峰面积及保留时间的重现性，结果显示保留时间 RSD% 均小于 0.15%，峰面积RSD% 均为 0，峰面积重现性良好也表明衍生效果稳定，定量结果可靠。具体结果见表 3
检出限(LOD) 和定量限(LOQ)
用浓度级别1 与浓度级别2 的标准品分别进样分析以考察检出限(LOD) 和定量限 (LOQ)（图 2a 和 2b），结果按照信噪比进行折算， LOD 取S/N=3 的浓度，LOQ 取S/N=10 的浓度，结果见表4。结果显示，此方法的检出限与定量限可以完全满足国标GBT 18979-2003 的要求。
图2. 2a (上) ，2b (下): 检出限(LOD) 和定量限(LOQ)
线性
五个不同浓度的标准品（浓度级别 2〜6）进样分析以考察线性 （图 3），4 种黄曲霉毒素的线性相关因子 R 均 >0.999，结果总结于 表 5 中：
图3. 5 个不同浓度标准品色谱图重叠(浓度级别2〜6)
样品分析
回收率分别使用标准品和加标样品按照相同前处理步骤和测定方法进行处理和测定以考察前处理和方法回收率，结果总结于表 6 中，可以看到标准品和加标样品测得的回收率值有很好的一致性，证明基质不会影响回收率，回收率数值在 55〜75% 之间，比免疫亲和小柱说明书中报告的值 (70〜110%) 略低。
图 4 为玉米粉样品与加标的玉米粉样品（浓度级别 4）色谱图的比较，将标准品加在样品处理前加入玉米粉当中，按照本报告前面叙述的前处理步骤进行处理。结果显示，未加标的玉米粉样品中不含有黄曲霉毒素，在加标样品中，我们可以看到目标组分与基质干扰峰有良好的分离。
图 5 为加标玉米粉样品（红色）和标准加入玉米粉样品（蓝色），标准加入玉米粉样品中含有 B1 ：9.00 ppb，B2：0.6 ppb。
图 6 为含有四种黄曲霉毒素的芝麻酱样品，可以看到，对于不同基质，此方法也可以保证目标化合物与基质干扰峰得到良好的分离。
图5. 加标玉米粉样品（红色）和标准加入玉米粉样品（蓝色）
图6. 芝麻酱样品
酸枣仁是一种常见中药，有镇静安神，镇痛，降低血压等作用，收载于中国药典 2010 版一部[9]当中，在“检查”项中要求对黄曲霉毒素进行测定。
图 7 为酸枣仁样品（蓝色）和标准品（红色）的色谱图，可以看出，被分析的酸枣仁样品当中不含有黄曲霉毒素。
图7. 酸枣仁样品（蓝色）和黄曲霉毒素标准品（红色）
不同样品的定量测定结果见表7.
考虑到回收率的影响，这些结果与确定含量的样品的真实含量相吻合，表明此方法定量结果可靠。
讨论
我们开发了一个使用简单的柱后光衍生设备及荧光检测同时测定食品基质中黄曲霉毒素 B1，B2，G1，G2 的方法。方法线性及重现性良好，在检出限和定量限上完全可以满足现行法规的要求，根据对实际样品的测试，此方法可以很好的 将被测成分与基质干扰峰分离。比起电化学柱后衍生方法，所需要的设备简单，而且避免了使用对于仪器损害严重的流动相添加剂。虽然光化学衍生的方法比电化学衍生法的灵敏度略低，但是仍旧可以很好的满足现行法规和标准的要求。