氨基甲酸酯类农药残留的检测方法
摘 要
建立一种高效液相色谱柱后衍生法测定饲料中9种氨基甲酸酯类农药（涕灭威砜、灭多威、3-羟基克百威、涕灭威、速灭威、克百威、甲萘威、异丙威、仲丁威）残留量的方法。样品采用乙腈提取，氨基固相萃取柱分离净化，浓缩，乙腈定容后，进行反相色谱梯度洗脱分离、柱后衍生化、荧光检测器测定。结果表明，9种氨基甲酸酯类农药在22min内能实现基线分离，方法的回收率为80.0%~110.0%，检出限为0.01 mg/kg，定量限为 0.05 mg/kg。
氨基甲酸酯类农药大量使用于玉米、大豆等主要饲料原料的农作物生产中,由于氨基甲酸酯类农药毒性较大，通过食物链传递,处于食物链终端的人类是最终的受害者,公众健康安全受到威胁[1]。目前,该问题越来越被重视,我国有关部门已于2003年制定了《饲料中氨基甲酸酯类农药残留量测定气相色谱法》[2]。但是，由于氨基甲酸酯类农药的极性和热不稳定性，该方法测定灵敏度和重现性均不是十分理想[3-4]，因此，开展氨基甲酸酯类农药残留量检测技术的研究具有重要意义[5]。本文在查阅相关文献的基础上[6-9]，研究了高效液相色谱法测定饲料中氨基甲酸酯类农药残留量的可行性，对饲料中氨基甲酸酯类农药残留的测定方法进行了研究，建立了一种高效、准确的液相色谱测定方法。本方法灵敏度高，稳定性好，适用于饲料中氨基甲酸酯类农药残留量的测定。
1.试验部分
1.1 仪器
Waters 2695高效液相色谱仪，配Waters2475荧光检测器和柱后衍生装置；3k30型冷冻离心机（Sigma公司）；B-490旋转蒸发仪(BüCHI公司);MS2minishaker旋涡混匀器(IKA公司)；AG-285电子天平（Mettler公司）；20通道固相萃取装置（Waters公司）。
1.2试剂与材料
涕灭威砜、灭多威、3-羟基克百威、涕灭威、速灭威、克百威、甲萘威、异丙威、仲丁威标准品均为德国D.E.公司产品，纯度≥96.0％；甲醇、二氯甲烷均为分析纯；乙腈为色谱纯；无水硫酸钠为分析纯；柱后衍生试剂：0.05mol/l NaOH溶液和OPA衍生试剂均购自美国Pickering公司；氨基固相萃取柱购自杭州富裕科技有限公司（500 mg/6 ml）。
1.3色谱条件
1.3.1 液相色谱柱条件
Waters Symmetry C18柱，250 mm×4.6 mm，粒径5.0 μm；进样量：20μl；流动相采用梯度洗脱，条件见表1，柱温：35 ℃。
1.3.2 柱后衍生条件
水解温度:85 ℃;碱液:0.05 mol/l；NaOH溶液,流速:0.3 ml/min;OPA试剂流速：0.3 ml/min；衍生温度:室温。
荧光检测器:激发波长330 nm;发射波长465nm。
1.4 标准溶液配制
1.4.1 OPA衍生试剂配制
准确称取100 mg邻苯二甲醛,用20 ml甲醇溶解,加入OPA稀释液940ml,备用。另取巯基乙醇2.0 g用10 ml OPA稀释液溶解，转移至上述溶液中，混匀，超声脱气，备用。
1.4.2农药标准溶液配制
1.4.2.1 单个农药标准溶液
准确称取适量农药标准品（精确至0.1 mg），用乙腈溶解，配制成1 000mg/l的单一农药标准储备液，贮存于-18 ℃以下冰箱中。使用时根据需要吸取适量标准储备液用乙腈稀释成标准工作液。
1.4.2.2农药混合标准溶液
准确吸取一定体积的单个农药储备液于同一容量瓶中,用乙腈稀释至刻度,配制成农药混合标准储备液,使用前用乙腈稀释成所需浓度的标准工作液。
1.5样品处理
1.5.1 试样制备
实验室样品经混合均匀后,按四分法缩减至100 g,粉碎,使之完全通过0.45mm筛孔，再充分混合，备用。
1.5.2 提取
准确称取试样（5±0.1） g置50 ml离心管中，加20 ml乙腈，涡旋1 min，6 000r/min离心5 min，分出上清液，过无水硫酸钠，收集于茄心瓶中，剩余物用20 ml乙腈重复提取一次，过无水硫酸钠，收集于同一茄心瓶中，50℃下旋转蒸发至干，备用。
1.5.3 净化
用4 ml甲醇-二氯甲烷(体积比为1：99)溶解茄心瓶内物质,转移至固相萃取柱(使用前用4ml甲醇-二氯甲烷平衡)中,收集流出液。再用4 ml甲醇-二氯甲烷(体积比为1：99)洗茄心瓶,重复一次,收集洗脱液,在50℃减压旋转蒸发浓缩至干,用乙腈定容至2.0 ml,过0.45 μm滤膜，上机测定。
1.5.4 色谱分析
分别吸取20μl标准混合溶液和净化后的样品溶液注入液相色谱仪中，以保留时间定性，以峰面积定量。
2 结果与讨论
2.1流动相的选择
试验中我们考察了甲醇-水、乙腈-水体系作为流动相对氨基甲酸酯类农药的分离效果。结果发现，甲醇-水、乙腈-水可以对氨基甲酸酯类农药实现分离，当乙腈-水体系作为流动相时，待测物氨基甲酸酯类农药的响应信号较强，分离效果更好，而甲醇-水体系流动相的极性杂质较多，个别峰峰形不理想，干扰较大，响应信号较低，故我们选择乙腈-水体系作为流动相，具体配比见表1。不同流动相体系图谱比较见图1，上机液浓度为200ng/ml。
2.2提取溶剂的选择
由于氨基甲酸酯类农药难溶于水,较易溶于甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂。我们分别选择甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯作为提取溶剂,在同一添加水平,相同实验条件下,对样品进行回收率试验。试验结果表明,使用乙酸乙酯、丙酮的回收率明显低于甲醇、乙腈作为提取剂的回收率,而甲醇使样品基质干扰较大,图谱基线漂移较大,因此,本方法采用乙腈作为提取剂。
2.3固相萃取柱条件的选择
根据查阅的资料，我们选择了氨基固相萃取柱作为净化柱，净化样品，洗脱剂选择甲醇-二氯甲烷（1：99）,对洗脱剂的用量进行了考察,结果表明,回收率随洗脱剂体积增加而增加，当体积达到8ml(4 ml+4 ml)后，继续增加洗脱液对回收率的影响不大。
采用以上确定的前处理方法，进行方法学考察，对配合饲料添加浓度为40ng/g的样品进行检测，所得空白样品和添加样品色谱图见图2。
2.4 线性方程和检出限
配制氨基甲酸酯类农药浓度20.0~500μg/l的系列混合标准溶液，按1.3节建立的仪器条件进行测定。分别以峰面积Y对含量X（μg/l）作标准曲线，9种农药的相关系数r均大于0.9995，在20.0~500 μg/l范围内具有良好的线性关系。以3倍信噪比为检出限(LOD)，9种待测农药的检出限达到0.01mg/kg，定量限（LOQ）为0.05 mg/kg。
2.5回收率试验
取同一批号的空白配合饲料样品，加适量混合标准工作液，使加标量为0.05、0.10、0.50mg/kg，按1.5节的方法处理后进行仪器分析。每个浓度点取5份样品，求其平均回收率，并计算批内相对标准偏差，结果详见表2。
由表2的数据可知，饲料中9种氨基甲酸酯类农药的加标量为0.05、0.10、0.50mg/kg时，批内相对标准偏差在11.5%以内，平均回收率在80％以上。在此基础上，把建立的方法应用于浓缩料、预混合饲料、单一饲料等样品的测定，均取得了满意结果。
3结论
本文建立了以乙腈为提取剂、经氨基固相萃取柱净化、高效液相梯度洗脱分离、荧光检测器检测，定性、定量测定饲料中9种氨基甲酸酯类农药残留量的方法。该方法测定农药种类较多，操作过程简单，测定结果准确，是测定饲料中氨基甲酸酯类农药行之有效的方法。